摘要：裂腹鱼亚科鱼类具有丰富的体表附属器官变异，而Edar是控制这类结构发育的关键基因。以5种裂腹鱼的代表物种为材料克隆其Edar基因的编码区片段，序列分析表明：该基因编码的蛋白在裂腹鱼中存在长度不同的组氨酸重复序列，串联组氨酸插入可能与蛋白定位有关；基因树支持裂腹鱼与金线具有最近的亲缘关系；分子进化分析未检测到正选择信号，裂腹鱼基因的低复杂区可能是受选择区域以上结果说明裂腹鱼Edar基因的结构变异可能与裂腹鱼表型变异和演化有关。
关键词：裂腹鱼亚科；体表附属器官；基因克隆；序列分析
中图分类号：Q951 文献标识码：A 文章编号：1007-7847（2015）01-0049-05
CloningandSequenceAnalysisofEctodysplasin-AReceptorGeneEdarinFiveSchizothoracineFishes
GUOXin-yi12，XIELing1ZHANGXu-ze3，JIYin-fa1，PANGBo1，2，GUOSong-chang1*
（1.KeyLaboratoryofAdaptationandEvolutionofPlateauBiota，NorthwestInstituteofPlateauBiology，ChineseAcademyofSciences，Xining810008，Qinghai，China；2.UniversityofChineseAcademyofSciences，Beijing100049，China；3.QinghaiUniversityforNationalities，Xining810007，Qinghai，China）
Abstract：Schizothoracinesubfamilyfishesarerichinvariationsofskinappendages.TheEdargeneplaysavitalroleinthedevelopmentofthesestructures.ThecodingregionsegmentsofEdargenewereobtainedfromfiverepresentativeSchizothoracinespecies.Histidinerepeatsofdifferentlengthswerefoundinthepro?teinsequencesofthisgeneinSchizothoracine.Tandemhistidineinsertsmightaccountforthelocalizationoftheprotein.ThegenetreeshowedthatSchizothoracinefishesclusteredwiththegolden-linefish.Signalsofpositiveselectionwerenotdetectedinourmolecularevolutionanalysis；whilethelowcomplextityregionofthisgenemightbethetargetforselection.IlisconcludedfromtheaboveresultsthatthestructuralmutationsinSchizothoracineEdargenemightl）erelatedtothephenotypicvariationandevolutioninthesespecies.
Keywords：Schizothoracine；skinappendages；genecloning；sequenceanalysis
（LifeScienceResearch，2015，19（1）：049?053）
脊椎动物体表附属器官的变异一直是进化和发育生物学家关注的问题。早在1875年，达尔文在《动物和植物在家养下的变异》一书中指出，毛发、羽毛、蹄、角以及牙齿等体表附属器官具有共同起源，并描述了一户印度家庭四代人少汗和毛发牙齿等发育缺陷的男性遗传疾病[1]。这种疾病后来被称为止汗或少汗型外胚层发育不良症（anhidrotic/hypohidroticectodermaldysplasia，HED/E-DA）。HED具有两大鲜明特征，一是同时影响多个外胚层发育而来的器官，二是受影响的人群主要为男性[2]。引起HED的基因主要有4种[3]：外胚层发育不良因子A（Ectodysplasin-A，Eda）、Eda受体（Ectodysplasin-Areceptor，Edar）、Eda受体相关的死亡结构域（Edarassociateddeathdomain，Edaradd）和Wnt基因家族成员中的研究表明，EDA信号通路非常保守，上述基因的突变不仅在狗、牛、大鼠、小鼠和人等哺乳动物中造成相似的外胚层发育不良表型，在鸡、斑马鱼和青鱼将等其他脊椎动物中也同样影响外胚层衍生的体表附属器官发育[2、4-7]。
裂腹鱼亚科（Schizothoracine）是鲤形目鲤科鱼类的一个分支，因肛门和臀鳍基部两侧扩大的臀鳞状似腹部有裂缝而得名。该亚科广泛分布于青藏高原及其毗邻地区，包含11～12属共100多种[8]。研究表明，在适应高原环境的过程中，裂腹鱼亚科鱼类的形态具有三大演化趋势：体[趋于退化、下咽齿行数趋于减少、触须趋于消失[9]。值得注意的是，裂腹鱼类群中这些发生变异的结构，均为外胚层衍生的附属器官。已经证明，在模式动物斑马鱼和青鱼中，Edar/Eda的突变会影响个体鳞片、鳍条和咽齿等结构的发育，且个体能存活到成体并具有可育性[6、7、10]。然而这些研究均为人工突变体筛选得到的结果，自然选择是否会通过这些基因来促进物种演化还不得而知。
研究EDA信号通路在裂腹鱼亚科鱼类表型变异中的作用，有助于在分子水平理解自然选择下体表附属器官的变异机制以及生物的适应性演化本研究首次对裂腹鱼亚科鱼类的Edar基因进行了克隆和序列分析，为揭示基因在裂腹鱼亚科鱼类表型变异中的作用奠定了基础。 1材料与方法1.1材料
1.1.1动物样品的采集
青海湖裸趣（Gymnocyprisprzewalskii）米集于青海省刚察县泉吉乡。由于青海湖裸鲤为国家二级保护动物，经当地有关部门批准，采用粘网捕获少量个体。异齿弓鱼（Schizothoraxo’oconnori）、双须叶须鱼（Ptychobarbusdipogon）和尖裸鲤（Oxy-gymnocyprisstewardi）购自西藏自治区拉萨市布达拉宫西鱼市。高原裸裂尻鱼（Schizopygopsisstoliczkcw）采集于西藏自治区日土县，采用粘网捕获。实验用鱼就地解剖并迅速将组织放入液氮中保存，带回实验室后置于-80℃冰箱保存。
1.1.2主要试剂
RNAVzol试剂盒购于北京威格拉斯生物技术公司，pGEM-Teasy载体购自Promega公司（美国），反转录试剂盒购于Thermo公司（美国），PCR所需10xBuffer、dNTP和ExTaq聚合酶购自大连宝生物公司，感受态DH5a购自北京全式金生物公司，DNA凝胶纯化试剂盒购自上海生工生物工程有限公司，其它生化试剂均为国产分析纯试剂。
1.2方法
1.2.1总RNA提取与第一链cDNA的合成
RNA提取采用RNAVzol试剂盒，参照说明书执行。每个物种选取一个个体，取100mg侧线上方白肌组织置于加入了预冷RNAVzol试剂的组织研磨器中，冰上迅速研磨至匀浆，裂解充分后经氯仿抽提、异丙醇沉淀和乙醇洗涤等步骤获得RNA沉淀。干燥的RNA沉淀以0.1%DEPC处理水溶解，利用Narwdrop2000紫外分光光度计测定值以确定纯度，并通过1%的琼脂糖凝胶电泳大致判断其完整性。第一链cDNA合成利用Thermo Scientific RevertAid FirstStrand cDNA Synthesis Kit进行。
1.2.2引物设计
从GenBank获取人（Homosapiens，NM_0223-36.3）、斑马鱼（Dowiorerio，NM_001115064.1）、青（Oryziaslatipes，NM_001104759.1）的EdarmRNA序列，用PrimerPremier6（PremierBiosoft，USA）软件在其高度保守区内设计引物，并利用NCB1的在线工具Primer-BLAST在斑马鱼RefseqmR-NA数据库中检查引物特异性。最终设计的引物序列为ER-F：5'-ATCGCCATGTCAACCATCTTC-ATC-3'和ER-R：5'-CGTCTTCACCACCGCCTT-ATCA-3'。
1.2.3cDNA克隆
以上述cDNA为模板，通过RT-PCR扩增5种裂腹鱼CDS片段。反应体系为50μL，其中cDNA（浓度约200ng/μL）2μL，包含10xBuffer5μL，dNTP（浓度为2.μmol/L）2.5μL，上下游引物（浓度为10μmol/L）各2μL，ExTaq聚合酶（5U/μL）0.5μL，加入ddH2O补足体积。反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性40s，57°C退火40s，72℃延伸50s，共38个循环，最后在72℃下延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，通过凝胶回收试剂盒回收目的片段，连接至pGEM-Teasy载体中，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，通过氨苄青霉素抗性筛选得到阳性克隆，其中每个平板挑取的克隆数目不少于3个。采用含氨苄青霉素的LB培养基进行扩大培养后送上海生工生物公司，利用M13引物进行双向测序，若发现不同克隆的测序结果不一致，则增加测序的克隆数目。
1.2.4序列比对与基因树的构建
测序结果通过BLAST确定是否为目标序列，同时从GenBank下载其他硬骨鱼Edar基因序列，纳入分析的物种包括：秀美花（poeclia for-mosa，XM_007557129.1）、三刺鱼（Masterosteusaculeatus，DQ985077.1）、白斑狗鱼（Esoxlucius，GATF01013030.1）、钳鱼（Ictaluruspunctatus，JT414449.1）和狭孔金线（Sinocyclocheilusan-gustiporus，GAHOO1128845.1）。利用MEGA5软件[11]对序列进行比对和人工处理，并利用DNAMAN软件生成氨基酸比对结果。通过jModelTest2.1.1软件[12]基于赤池信息准则（Akaikeinformationcri-teri0n，AIC）选择最佳的核酸替代模型，进而构建最大似然树和贝叶斯树。最大似然树的构建采用PAUP4.0b10[13]及PaupUp图形化界面，通过启发式搜索算法进行1000次重复（方式为random-addition-sequence），Bootstrap进行1000次重复以获得支持度。贝叶斯树的构建采用MrBayes3.2.1软件[14]，两组重复同时进行，每组4条Metropo-lis-coupledMarkovchains（3条热链和1条冷链），运行10000000代MonteCarlo，取样频率为每1000代，舍弃前50%样本，进而利用剩下的5002棵样本树生成50% majority-rule一致性树。
1.2.5分子进化分析
采用PAML4.7a软件包[15]中的codeml程序对裂腹鱼Edar基因进行分支模型、位点模型和分支位点模型分析。因裂腹鱼属（Schizothorax）最为原始，在分析时将裂腹鱼支系和除裂腹鱼属的异齿弓鱼外的其他裂腹鱼支系分别作为前景支，其他物种作为背景支。所有嵌套模型均采用似然比检验法（LRT），利用卡方检验判断两模型间的似然函数对数值（InL，l）的差异（2□l）是否显著。 2结果
2.1测序结果和序列比对
本实验获得5种裂腹鱼的Edar基因CDS片段长度为585～612bp，其中青海湖裸鲤的序列最长（612bP），异齿弓鱼的序列最短（585bp）。翻译成氨基酸后，本研究获得的序列对应EDAR蛋鹊目缒で和死亡结构域之间的区域，与斑马鱼相比，裂腹鱼的序列中具有不同程度的插入缺失（图1）。此外，该基因在异齿弓鱼、双须叶须鱼和高原裸裂尻鱼分别存在两种单倍型（见表1，分别编号为1和2）。值得注意的是，与其他几种硬骨鱼相比，裂腹鱼类在该蛋白的一处低复杂区域存在不同长度的组氨酸（His，H）插入，其中异齿弓鱼无插入，双须叶须鱼插入1或3个，其他裂腹鱼类插入3-5个。
2.2基因树的构建
基于获得的序列联合其他已知的硬骨鱼Edar序列，进行最大似然方法和贝叶斯方法的基因树构建，结果显示两种方法得到的基因树结构一致（图2），且节点处的贝叶斯后验概率（bayesianposteriorprobability，BPP）及基于最大似然法的bootstrap值（BP）也较为一致其中鲤形目的斑马鱼、狭孔金线、裂腹鱼类聚为一支（BPP=91，BP=65），青、秀美花、三刺鱼和白斑狗鱼聚为一支（BPP=100 BP=100），钳鱼单独为一支。这一结果显示裂腹鱼类与金线具有较近的亲缘关系。值得注意的是，裂腹鱼的特化类群形成一个支持度较高的多岐分支（BPP=100，BP=92），而该分支内部的系统发育关系却不能得到解析。
2.3分子进化分析
利用PAML软件进行的分子进化分析结果见表2。分支模型分析显示，不论是否将异齿弓鱼纳入前景支进行分析，似然比检验的结果均不支持裂腹鱼支系的氨基酸非同义/同义替换比率（dN/ds，w）发生显著变化（P>0.05）。同时，分支位点模型分析的结果也不支持裂腹鱼支系存在正选择位点（P>0.05）。在位点模型分析中，M3与M0模型的比较显示该基因不同位点的氨基酸替换比率在物种间具有异质性（P=0），而M8和M7模型以及M2和M1模型的LRT检验均不支持Edar基因在硬骨鱼中存在正选择位点（
0.05）.
3讨论
本实验克隆了5种裂腹鱼亚科鱼类的Edar基因CDS片段，并将其编码的氨基酸序列与其他硬骨鱼的该基因氨基酸序列进行了分子进化分析。Edar基因为肿瘤坏死因子受体（tumornecro?sisfactorreceptor，TNFR）超家族的一员，其编码的EDAR蛋白为分泌型的跨膜蛋白，包含信号肽序列、TNFR位点、跨膜区、低复杂区域和死亡结构域[2、16]。研究表明Edar的5’UTR和3’UTR区域在不同物种间差异较大，其信号肽序列的同源性也不高，且跨膜区两端的低复杂区域也具有较大变异，说明该基因发挥生物学作用的途径可能具有物种特异性[16]。本研究发现，裂腹鱼EDAR蛋白的低复杂区域存在不同数目的组氨酸插入。已有研究表明，蛋白序列中的串联组氨酸插入可能影响分泌型蛋白的靶向部位，从而改变蛋白的生物学效应[17]。此外，裂腹鱼中的组氨酸插入呈现一定的规律性，即具有不同插入缺失数目的物种正好可以对应曹文宣等[9]划分的裂腹鱼的3个等级。然而，在青海湖裸鲤和尖裸鲤中我们没有检测到其他单倍型，这可能是由于测序的克隆数目不够。此外，利用Edar片段构建的基因树并不能很好地反映裂腹鱼的进化关系，这可能是由于该片段为核基因CDS片段，积累的变异较少，因此无法准确反映较低阶元的物种发生关系。另外，本试验的分子进化分析并没有提供Edar基因发生正选择的证据，这可能是因为该基因所受自然选择正是发生在上述发生插入事件的低复杂区域，而PAML软件无法对插入缺失的信息进行很好的处理[15]。
影响生物表型变异与演化的因素有很多，研究人员基于基因序列上的变化提出了两种假说，即支持变异与演化由基因调控区域主导的“调控变异”（regulatorymutation）假说和支持由编码区变异主导的“结构变异”（structuralmutation）假说[18]。在本研究中，裂腹鱼Edar基因在编码序列中存在结构变异，即氨基酸序列的变异和插入缺失。鉴于该基因在外胚层衍生的体表附属器官发育中的重要作用，我们推测这些结构变异与裂腹鱼相应结构的演化存在密切联系，有必要在今后的工作中对裂腹鱼亚科鱼类Edar基因的表达调控及该信号通路上的其他基因如Eda、Edaradd等进行研究。
[1]DARWIN C. The variation of animals and plants under domestication[M]. London： John Murray， 1868.
[2]SADIER A， VIRIOT L， PANTALACCI S， et al. The ectodys- plasin pathway： from diseases to adaptations[J]. Trends in Ge?netics， 2014， 30（1）：24-31.
[3]CLUZEAU C， HADJ-RABIA S， JAMBOU M， et d. Only four genes （EDA1， EDAR， EDARADD， and WNT10A） account for 90% of hypohidrotic/anhidrotic ectodermal dysplasia cases[J]. Human Mutation， 2011，32（1）： 70-72.
[4]KURAMOTO T， YOKOE M， HASHIMOTO R， et al. A rat model of hypohidrotic ectodermal dysplasia carries a missense mutation in the Edar add gene[J]. BMC Genetics， 2011， 12（1）： 91. [5]CUI C Y， KUNISADA M， PIAO Y， et al. Dhk4 and Eda regu?late distinctive developmental mechanisms for subtypes of mouse hair[J]. PloS One， 2010， 5（4）： el0009.
[6]HARRIS M P， ROHNER N， SCHWARZ H， et al. Zebrafish eda and edar mutants reveal conserved and ancestral roles of ectodysplasin signaling in vertebrates [J]. PLoS Genetics， 2008， 4（10）： el000206.
[7]KONDO S， KUWAHARA Y， KONDO M， et al. The medaka rs-3 locus required for scale development encodes ectodys plasin-A receptor[J]. Current Biology， 2001， 11（15）： 1202-1206.
[8]QI D， CHAO Y， GUO S， et al. Convergent， parallel and correlated evolution of trophic morphologies in the subfamily schizothoracinae from the Qinghai-Tibetan plateaufJl. PloS One， 2012，7（3）： e34070.
[9]CAO W， CHEN Y， WU Y， et al. Origin and evolution of schizothoracine fishes in relation to the upheaval of the Xizang Plateau[C]//Tibetan Expedition Team of the Chinese Academy of Science. Studies on the period， amplitude and type of the uplift of the Qinghai-Xizang Plateau. Beijing： Science Press. 1981.118-130.
[10]HARRIS M P. Comparative genetics of postembryonic develo?pment as a means to understand evolutionary change [J]. Journal of Applied Ichthyology， 2012， 28（3）： 306-315.
[11]TAMURA K， PETERSON D， PETERSON N， et al. MEGA5： molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood， evolutionary distance， and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution， 2011，28（10）： 2731 - 2739.
[12]DARRIBA D，TABOADA G L， DOALLO R， et cd. jModelTest 2： more models， new heuristics and parallel computingfj]. Nature Methods， 2012， 9（8）： 772.
[13]SWOFFORD D L. PAUP*： phylogenetic analysis using parsi?mony， version 4.0 b 10[Z]. Sinauer Associates， Sunderland， Massachusetts， 2003.
[14]RONQUIST F， TESLENKO M， VAN DER MARK P， et al. MrBayes 3.2： efficient Bayesian phylogenetic inference and model choice across a large model space [J]. Systematic Biology， 2012， 61（3）： 539-542.
[15]YANG Z. PAML 4： phylogenetic analysis by maximum likelihood [J]. Molecular Biology and Evolution， 2007， 24（8）： 1586- 1591.
[16]蒋丽，王阳阳，程安达，等.鲤鱼（Cyprinus corpio）外异蛋白A受体Edar基因的克隆及表达定位[J].生物技术通报（JIANG Li， WANG Yang -yang， CHENG An -da， et cd. Preliminary study of Edar gene cloning and localization of expression in Cyprinus carpic[J]. Biotechnology Bulletin）， 2013， （12）： 99-107.
[17]SALICHS E， LEDDA A， MULARONI L， et al. Genome-wide analysis of histidine repeats reveals their role in the localiza?tion of human proteins to the nuclear speckles compartment [J]. PLoS Genetics， 2009， 5（3）： el000397.
[18]HOEKSTRA H E， COYNE J A. The locus of evolution： evo devo and the genetics of adaptation[J]. Evolution， 2007， 61（5）： 995-1016.
五种裂腹鱼亚科鱼类外胚层发育不良因子A受体基因Edar的克隆和序列分析
